Transformation (Genetik)

Als Transformation wird in der Molekularbiologie die nicht-virale Übertragung von freier DNA in kompetente Bakterienzellen sowie in Pilze, Algen, Hefen und Pflanzen bezeichnet. Unter Transfektion versteht man eine DNA-Insertion in eukaryotische Tierzellen. Die Transformation ist neben der Transduktion und der Konjugation eine von drei Möglichkeiten des Gentransfers bei Prokaryoten.

Geschichte

Das auch natürlicherweise auftretende Phänomen wurde zum ersten Mal 1928 von Frederick Griffith experimentell hervorgerufen und beschrieben. 1944 gelang Oswald Avery und seinen Mitarbeitern der Nachweis, dass es sich dabei um eine Übertragung von Desoxyribonukleinsäure (DNS) handelt.

Anwendung

Die Transformation wird in der Gentechnik genutzt, um in Bakterien rekombinante DNA - nach einer Klonierung von DNA-Abschnitten in einen Vektor - zu vervielfältigen. Die so erzeugten DNA-Varietäten werden durch Gentransfer in fremde Zellkerne eingeschleust, um transgene Tiere oder Pflanzen zu erzeugen.

Methoden

Freie DNA, im Normalfall ein Plasmid, kann zu Bakterien gegeben werden, die die DNA bei geeigneter Behandlung aufnehmen können. Hierbei macht man sich die natürliche Kompetenz zu Nutze, die Bakterienzellen zur Aufnahme fremder DNA zu bringen.

Bei einigen Bakterien, etwa Escherichia coli, besteht jedoch keine natürliche Kompetenz, so dass vorbereitende Schritte für die Transformation notwendig sind.

Die einfachste Methode zur Transformation ist der sogenannte Hitzeschock. Die Bakterienzellen werden hierbei mit Calciumchlorid oder effektiver mit Rubidiumchlorid behandelt, so dass zwischen der negativ geladenen DNA und der negativ geladenen Zellmembran weniger abstoßende Kräfte bestehen. Bei einem kurzen Hitzeschock (41–43 °C für 45–90 Sekunden) entstehen Poren in der Membran, so dass die DNA in die Zellen gelangen kann.[1] In vielen Fällen ist ein Hitzeschock durch das Ausplattieren auf 37 °C warme Agarplatten ausreichend.[2] Dadurch ist die Transformation in wenigen Minuten durchführbar.

Eine weitere Methode ist die sogenannte Elektroporation. Hierbei werden die Bakterien mit einem elektrischen Schock behandelt (2000-2500 V für einige Millisekunden), um die Membran zu öffnen.[3] Diese Methode ist in vielen Fällen effektiver als die chemische Methode.[4] Allerdings muss das Medium mit den Bakterien eventuell entsalzt werden, da es sonst zu einem Kurzschluss kommen kann.

Mechanismen

Bakterien besitzen eine Kompetenz freie DNA aufzunehmen. Diese wird durch verschiedene Kompetenzproteine bestimmt, die durch Quorum sensing oder Nährstoffmangel verstärkt exprimiert werden. Aus dem Grund, dass gramnegative und grampositive Bakterien eine andere Zellwandstruktur besitzen, ist zwischen diesen zu unterscheiden.

Gramnegative Bakterien binden freie DNA an einem Kompetenzprotein. Durch Endonukleasen wird die DNA in der Länge von 18kbp gespalten und einsträngig in die Zelle importiert. Der andere, übrig geblieben Strang wird durch Nukleasen abgebaut. Grampositive Bakterien besitzen für den Import der freien DNA einen Secretin-Kanal an der äußeren Membran sowie einen DNA-Transporter an der inneren Membran. Die DNA wird zuerst durch das Secretin importiert. Schließlich wird die DNA einsträngig durch den Transporter importiert und der zweite Strang abgebaut.

Nach der Aufnahme der einsträngigen DNA kommt es zu der Bindung mit der doppelsträngigen DNA der Zelle. Dabei entsteht eine Trippelhelix bei der das RecA-Protein DNA-Abschnitte austauscht. Dabei kommt es zu Insertionen und Deletionen an der Bakterien-DNA. Durch die Replikation der DNA entstehen nun zwei unterschiedliche Stränge, aus dem Grund, dass die importierte DNA nur mit einem Strang rekombiniert wurde.

Einzelnachweise

  1. Calciumchloridmethode (engl.)
  2. Pope, B. and H. M. Kent (1996). "High efficiency 5 min transformation of Escherichia coli." Nucleic Acids Research 24(3): 536-537.
  3. Info zur Elektroporation
  4. Vergleich verschiedener Transformationsmethoden (PDF)

Literatur

  • Michaela Scherr & Dietmar Scherr (2003): Das "Avery-Experiment": Meilenstein der Molekularbiologie. In: Biologie in unserer Zeit. Bd. 33, S. 58-61. doi:10.1002/biuz.200390010

Siehe auch

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