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Heute im BIO-UNTERRICHT: | Klonierung ✔ |

Klonierung (oder Klonieren, engl. molecular cloning) ist in der Molekularbiologie der Überbegriff für Methoden zur Gewinnung und identischen Vervielfältigung von Desoxyribonukleinsäure (DNA). Im Gegensatz zum Klonen, dessen Ziel in der Herstellung genetisch identischer Organismen besteht, beschränkt sich die Klonierung auf die Herstellung identischer Moleküle der DNA.

Bei der Klonierung wird ein gewünschtes DNA-Fragment (ein Gen) in einen Vektor (ein Plasmid) integriert. Das Ziel einer Klonierung ist, ein DNA-Fragment (beispielsweise für In situ-Hybridisierungen) zu vermehren, um seine Eigenschaften zu untersuchen. Nach einer Vervielfältigung kann durch Isolation der gesamten DNA ein Vielfaches der anfangs eingesetzten DNA-Menge gewonnen werden, was kostengünstig, präzise und in großer Zahl (i.G. zu in vitro-Verfahren wie PCR) geschieht. Alternativ können die Zellen ein Genprodukt wie Protein rekombinant exprimieren (beispielsweise bei einer Proteinüberexpression). Solche Proteine spielen eine Rolle

Für die Vervielfältigung der Klonierungsprodukte werden verschiedene Organismen als Wirt genutzt. Bekannte Beispiele sind Bakterienzellen wie das Bakterium Escherichia coli, einzellige Algen oder Pilze (Biotechnologie). Die Wirtszellen vermehren sich dabei durch Zellteilung, wobei auch identische Kopien der zu klonierenden Ziel-DNA hergestellt werden. Das Resultat ist eine Population von Zellen, die alle einen Klon des gewünschten DNA-Fragments enthalten.

Weiterhin kann die Klonierung auch dazu verwendet werden, ein oder mehrere Gene auf fremde Organismen zu übertragen, Stoffwechselprozesse zu verbessern oder Resistenzen zu verleihen (bei Tieren und Pflanzen), was zur Genmanipulation führt.

Technik

Schematische Darstellung einer Klonierung mit Restriktion und Ligation.

Beim Klonieren werden sogenannte Vektoren („Genfähren“) verwendet. Diese dienen als Transportvehikel zur Übertragung einer bestimmten DNA-Sequenz in eine Empfängerzelle.

Ligation

Bei der Plasmidklonierung wird ein Plasmid (beispielsweise pBR322) mit Hilfe von speziellen Restriktionsenzymen versetzt geschnitten, so dass überhängende Enden (engl. sticky ends, klebrige Enden) entstehen. Die Ziel-DNA, die in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus genomischer DNA amplifiziert wurde und nun als Insert in den Vektor integriert werden soll, wird mit den gleichen Enzymen geschnitten, so dass komplementäre Enden an Vektor- und Ziel-DNA entstehen. Die zueinander kompatiblen, überhängenden Enden von Vektor und Ziel-DNA finden sich und hybridisieren miteinander. In der nachfolgende Ligation, die durch eine DNA-Ligase (z. B. T4-DNA-Ligase) katalysiert wird, werden die Enden der Einzelstränge miteinander kovalent verbunden.

Schematische Darstellung der Transformation einer rekombinanten DNA in eine Bakterienzelle und anschließender Antibiotika-Selektion.

Selektion

Im Anschluss folgt die Transformation kompetenter Bakterienzellen (etwa E. coli) mit dem Vektor-Insert-Konstrukt. Die Selektion der Zellen, die die Chimäre tatsächlich aufgenommen haben, wird nun in zwei Schritten durchgeführt. Zuerst werden die Bakterienzellen, die kein Plasmid aufgenommen haben, abgetötet. Hat eine Bakterienzelle das Plasmid ins Zellinnere aufgenommen, so kann diese mit Hilfe eines auf dem Plasmid vorhandenen Antibiotikum-Resistenzgens auf einem Agar-Nährboden (z. B. LB-Medium oder YT-Medium) wachsen, der das entsprechende Antibiotikum (z. B. Ampicillin oder Kanamycin) enthält. So werden nur diejenigen Bakterienzellen selektiert, die ein Plasmid aufgenommen haben. Durch Vermehrung dieser einzelnen Bakterienzelle entstehen Bakterienkolonien. Alle untransformierten und somit nicht gegen das verwendete Antibiotikum resistenten Bakterien sterben.

Bei der Ligation nehmen bei weitem nicht alle Plasmide das zu vervielfachende DNA-Fragment auf. Daher ist ein weiterer Schritt der Selektion von Nöten. Solche unveränderten Plasmide können Folge einer vorzeitigen Schließung des Plasmids oder einfacherweise die Nichtaufnahme eines DNA-Fragments in der Polylinker-Region sein. Da für den weiteren Verlauf nur die Plasmide von Interesse sind, die das zu vervielfachende Oligo - bzw. Polynukleotid enthalten, müssen diese unbrauchbaren Vektoren ausgemustert werden, wofür der folgende Schritt von Bedeutung ist.

Im zweiten Schritt findet die Selektion durch färbende Substanzen oder Kolonie-PCR statt, wobei sich im Folgenden speziell auf den oft verwendeten Vektor pUC18 und dessen Abkömmlinge bezogen wird. Seine Polylinker-Region befindet sich auf dem Gen lacZ, das das Enzym β-Galactosidase codiert. Im unveränderten Plasmid wird dieses Enzym exprimiert und ist in der Lage, ß-glykosidische Bindungen der Galactose hydrolytisch zu spalten. Ist dieser Vektor jedoch transformiert, so unterbricht das eingesetzte DNA-Fragment das besagte Gen, wodurch keine aktive ß-Galactosidase mehr exprimiert werden kann. Im Falle des genannten Vektors, wird dieses Phänomen durch Verwendung des farblosen Glykosids X-Gal genutzt. Dessen wässrige Lösung wird auf die - nach der ersten Selektion übriggebliebenen - Bakterienzellen aufgetragen. Die Moleküle des X-Gals bestehen aus β-D-Galactose, die an ein Indigoderivat gebunden ist. Nehmen nun die Bakterienzellen, die ein oder mehrere untransformierte Plasmide enthalten, diese Substanz auf, so wird die Bindung zwischen der β-Galactose und dem Indigoderivat durch das expremierte Enzym β-Galactosidase gespalten, wodurch das ungebundene, blau färbende, Indigoderivat entsteht. Die Entstehung von blauen Kolonien weist auf das Vorhandensein von Bakterienzellen mit unveränderten Vektoren hin, während die ungefärbten Kolonien möglicherweise das Gen enthalten, da das Enzym bei einem Vektor mit Insert inaktiv ist.

Zur weiteren Vermehrung impft man mit einer solchen Kolonie ein Flüssigmedium an. Aus einem solchen Ansatz kann eine große Menge Plasmid-DNA isoliert (Plasmidpräparation) werden. Die DNA steht dann für weitere Klonierungen oder Transformationen zur Verfügung.

Alternative Technologien

Siehe auch

Literatur


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