Plaque-Assay

Ungefärbte Plaques nach Färbung mit Methylenblau
Plaque-Assay in verschiedenen Verdünnungsstufen des Herpes-simplex-Virus

Ein Plaque-Assay (frz. plaque [plak] für „Platte; Fleck; Schild“) ist ein Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von infektiösen cytopathischen Viren, bei dem eine zu untersuchende Probe in unterschiedlichen Verdünnungen in eine Zellkultur eingebracht wird.

Prinzip

Aufgrund eines cytopathischen Effektes kommt es nach Infektion von Zellen mit Viruspartikeln (synonym Virionen) zur Lyse der Zellen und deren unmittelbaren Nachbarzellen. Nach Lyse dieser Zellen gelangen freigesetzte Viruspartikel wiederum in benachbarte Zellen, das Virus breitet sich dadurch immer weiter aus. So kommt es zu einem Fleck in einem konfluenten Zellrasen, in dem die Zellen lysiert wurden und den man als Lysishof oder Plaque bezeichnet. Wird ein infizierter Zellrasen nach einer angemessenen Zeit, in der sich solche Plaques bilden konnten, fixiert, gefärbt und gewaschen, so erkennt man die Plaques als leere, nicht gefärbte Stellen, von denen sich die toten, lysierten Zellen beim Waschen teilweise abgelöst haben. Die Plaques werden gezählt und zusammen mit dem bekannten eingesetzten Volumen wird die Konzentration an infektiösen Viruspartikeln in der untersuchten Probe ermittelt, typischerweise als Infektiöse Einheiten je Milliliter, IE/ml, oder plaque forming units je Milliliter, PFU/ml.

Im Gegensatz zur Konzentrationsbestimmung von Viren im Blut oder Serum im Sinne einer Viruslast mittels Nachweis der viralen DNA oder RNA durch PCR und eine evtl. vorangehende Reverse Transkription, werden beim Plaque-Assay inaktivierte oder nicht-infektiöse Partikel innerhalb einer Viruspopulation nicht erfasst. Der Plaque-Assay ist daher ein direktes Maß für die Konzentration infektiöser Partikel in einer Probe. Da jedoch nicht alle auf die Zellen gegebenen infektiösen Virionen auch (nach der Virenzugabe und vor der Polymerzugabe) zu einer Infektion führen, und nicht alle Viruspartikel weit genug voneinander entfernt auf den Zellrasen gelangen, werden im Plaque-Assay tendenziell zu niedrige Werte ermittelt.

Zur Verbesserung der Genauigkeit der Methode können die Zellen nach der Infektion mit einem Polymer (z. B. low-melting Agarose[1] oder Zellulosepulver[2]) überschichtet werden. Diese Beschichtung verhindert während der drei Tage des Versuchs bei Stößen oder Vibrationen eine ungewollte Infektion von Zellen über das Kulturmedium und erlaubt nur direkte Infektionen von Nachbarzellen, da sonst möglicherweise über das Medium Plaques von Tochtervirionen der folgenden Generationen entstehen können und eine zu hohe Konzentration ermittelt würde.

Bei Viren, die keinen cytopathischen Effekt aufweisen, kann die Viruskonzentration über die tissue culture infectious dose of 50% (TCID50) bestimmt werden.[3] Diese Methode basiert auf der Infektion der Zellkultur und einem beliebigen Nachweis (z. B. PCR), ob eine Zellkultur nach einem längeren Zeitraum (z. B. sieben Tage) überhaupt infiziert ist. Die Bestimmung der TCID50 umgeht das Problem der Infektion durch Tochtervirionen durch die Vermeidung einer Zählung von Plaques, da nur die Grenzverdünnungen ermittelt werden, bei der noch eine Infektion stattfindet.

Anwendungen

Mit dem Plaque-Assay können nur Viruspartikel-Konzentration von Viren nachgewiesen werden, die eine verwendete Zelllinie infizieren können, darin replizieren und auch zur Lyse der Zellen führen. Der Plaque-Assay kann bei lytischen Viren auch zur Bestimmung der Viruslast, eines Virustiters oder der minimalen Infektionsdosis verwendet werden.

Der Plaque-Assay kann neben der Bestimmung der Konzentration infektiöser Virionen auch in einem Virus-Neutralisations-Assay (synonym Plaque-Reduktions-Assay) zum Nachweis infektionshemmender Antikörper gegen Teile des Virions dienen, wenn Viren in bekannter Konzentration mit einer auf neutralisierende Antikörper zu testenden Probe vorher inkubiert werden. Binden die Antikörper an jene Oberflächenepitope der Viren, die zur Aufnahme in die Zelle notwendig sind, so sieht man im Plaque-Assay eine Verringerung der PFU/mL.[4]

Der Plaque-Assay wird auch genutzt, um die Wirkung von Desinfektionsmitteln zu untersuchen, bei denen das virale Genom nicht beeinträchtigt wird und unverändert nachweisbar bleibt, hingegen die Infektiosität der Virionen reduziert wird. Mit dem Plaque-Assay kann auch untersucht werden, wie hoch die Konzentration von infektiösen Viren in einer gesammelten Probe oder nach einer Virusanzucht im Zellkulturmedium ist. Bei vielen Viren (insbesondere RNA-Viren) ist nur ein geringer Prozentsatz der freigesetzten Virionen auch tatsächlich infektiös.

Der Vorläufer des Plaque-Assays erfasste bei Influenzaviren anhand der Veränderung des Amnions infizierter embryonierter Hühnereier die Anzahl focus forming units pro Milliliter.

Literatur

  • H. L. Bachrach, J. J. Callis et al.: A plaque assay for foot-and-mouth disease virus and kinetics of virus reproduction. Virology (1957) 4(2): S. 224-36 PMID 13496542
  • P. D. Cooper: The plaque assay of animal viruses. Adv Virus Res (1961) 8: S. 319-78 PMID 13881155

Einzelnachweise

  1. C. R. Gaush, T. F. Smith: Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl Microbiol. 16(4):588-94 (1968). PMID 5647517.
  2. M. Matrosovich, T. Matrosovich, W. Garten, H. D. Klenk: New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol J. 3:63 (2006). PMID 16945126.
  3. Y. Gao, I. Nankya, A. Abraha, R. M. Troyer, K. N. Nelson, A. Rubio, E. J. Arts: Calculating HIV-1 Infectious Titre Using a Virtual TCID50 Method. Methods in Molecular Biology Vol. 485 Page 27-35 (2008). PMID 19020816.
  4. M. de Graaf, S. Herfst, E. J. Schrauwen et al.: An improved plaque reduction virus neutralization assay for human metapneumovirus. J Virol Methods 143(2): S. 169-74 (2007). PMID 17420056.

Die News der letzten Tage

26.09.2022
Anthropologie | Paläontologie | Klimawandel
Evolution des Menschen: Klimaschwankungen in Ostafrika ein Motor
Interdisziplinäre Forschung in Südäthiopien zeigt, wie Schlüsselphasen des Klimawandels die menschliche Evolution beinflusste.
26.09.2022
Ökologie | Klimawandel | Meeresbiologie
Schritthalten mit dem Klimawandel?
Die für die Nahrungsnetze der Ozeane wichtigen Copepoden können sich genetisch an wärmere und saurere Meere anpassen.
26.09.2022
Anthropologie | Mikrobiologie | Physiologie
Mehr als nur Bauchgefühl
Die Strömungsgeschwindigkeit in unserem Verdauungssystem bestimmt unmittelbar, wie gut die Nährstoffe vom Darm aufgenommen werden und wie viele Bakterien darin leben.
26.09.2022
Biodiversität | Insektenkunde | Land-, Forst- und Viehwirtschaft
Mehrjährige Blühstreifen in Kombination mit Hecken: das gefällt unseren Wildbienen
Landwirtinnen und Landwirte sollten ein Netzwerk aus mehrjährigen Blühstreifen in Kombination mit Hecken schaffen, um Wildbienen ein kontinuierliches Blütenangebot zu bieten.
21.09.2022
Physiologie | Ethologie
Der australische „Ant-Slayer“: Spinne mit akrobatischer Jagdstrategie
Die Australische Kugelspinne Euryopis umbilicata lebt auf den Stämmen von Eukalyptusbäumen und versteckt sich tagsüber unter der Rinde.
21.09.2022
Ethologie | Primatologie
Steinwerkzeugvielfalt bei Schimpansen
Forschende haben gezeigt, dass Schimpansen in Westafrika Steinwerkzeuge benutzen und über eine ausgeprägte und wiedererkennbare materielle Kultur verfügen.
20.09.2022
Ökologie | Säugetierkunde
Neues von den Eichhörnchen in Berlin
Eichhörnchen gehören zu den in Großstädten wie Berlin am häufigsten gesichteten Wildtieren.
19.09.2022
Taxonomie | Insektenkunde
Wie viele Ameisen gibt es eigentlich?
Wie viele Sterne zählt unsere Galaxie?
19.09.2022
Zytologie | Genetik
Reparaturtrupp im Moos funktioniert auch im Menschen
Wenn in lebenden Zellen alles rund laufen soll, dann müssen die Erbinformationen stimmen, doch leider häufen sich im Laufe der Zeit durch Mutationen Fehler in der DNA an.