Elektrophorese

Elektrophorese mit über PCR gewonnenen DNA-Fragmenten, wobei (1) der Vater, (2) das Kind und (3) die Mutter ist.

Elektrophorese (veraltet Kataphorese) bezeichnet die Wanderung kolloidaler Teilchen durch ein elektrischen Feld.[1]

Beschreibung

Die Wanderungsgeschwindigkeit v ist bei der Elektrophorese proportional der Feldstärke E und der Ionenladung Q, umgekehrt proportional dem Teilchenradius r und der Viskosität η des Stoffes. Bei der Gelelektrophorese spielt auch das Verhältnis zwischen dem Teilchenradius und der Porenweite des als Trägermedium dienenden Gels eine Rolle, weil das Gel als Molekularsieb wirkt, so dass sich ein größerer Teilchenradius stärker hemmend auf die Wanderungsgeschwindigkeit auswirkt, als nur durch die Viskosität allein zu erwarten wäre. Durch die unterschiedliche Ionenladung und den Teilchenradius bewegen sich die einzelnen Stoffe (Moleküle) unterschiedlich schnell durch das Trägermaterial und erreichen eine Auftrennung entsprechend ihrer elektrophoretischen Mobilität. Damit eignet sich die Elektrophorese sehr gut zur Trennung von Stoffgemischen (insbesondere Molekülgemischen). Als Trägermaterial können Flüssigkeiten, Gele (siehe Gelelektrophorese, meistens mit Polyacrylamid oder Agarose) oder Feststoffe zum Einsatz kommen.

Agarose-Gele kommen vor allem bei der Auftrennung von DNA-Fragmenten zum Einsatz, während Proteine meist in Polyacrylamid-Gelen aufgetrennt werden. Als Verfahren kommen bei Proteinen SDS-PAGE und Western Blot zum Einsatz. Proteine müssen als Zwitterionen mit zusätzlichen Ladungen durch ein Detergens wie Natriumdodecylsulfat (engl. sodium dodecyl sulfate, SDS) beladen werden, um von einer Auftrennung nach den heterogenen Ladungsdichten zu einer Auftrennung nach der Molekülmasse zu kommen. Durch Zugabe von SDS und Aufkochen (Denaturieren) adsorbieren die Proteine proportional zu ihrer aufgefalteten Länge (und auch proportional zur Molekülmasse) das aliphatische Ende des negativ-geladenen Natriumlaurylsulfats. Dabei binden circa 1,4 Gramm SDS pro Gramm Protein in einprozentigen SDS-Lösungen. Die negativ geladenen Sulfatgruppen der SDS-Moleküle stoßen sich gegenseitig ab, was die Auffaltung (Linearisierung) der Proteine fördert, sofern das Protein keine Disulfidbrücken aufweist. Daher werden bei der Molmassenbestimmung zusätzlich Reduktionsmittel zur Überführung der Disulfide in Thiole hinzugegeben. Da mehrere hundert negativ geladene SDS-Moleküle an die Proteinmoleküle binden, kann die Eigenladung der Proteine im basischen pH des Gels vernachlässigt werden.

Elektrophoretische Mobilität

Zwei SDS-Gele nach dem Ende des Probenlaufs und Färbung der Proteinbanden mit Coomassie

Die elektrophoretische Mobilität von zwei zu trennenden Teilchen muss unterschiedlich sein, um eine Trennung mittels Elektrophorese zu erreichen. Die elektrophoretische Mobilität ist die Summe vieler physikalischer Faktoren, die letztendlich die Wanderungsgeschwindigkeit eines Teilchens während der Elektrophorese beeinflussen. Die generell treibende Kraft, die die Bewegung der Teilchen hervorruft, ist die Kraft F, die auf ein Teilchen mit bestimmter Ladung q innerhalb eines elektrischen Feldes mit gegebener Feldstärke E wirkt.

$ F=q\cdot E $

Dem entgegen wirkt zunächst eine Kraft, die sich durch die Viskosität $ \eta $ und die Größe des Teilchens (idealisiert für sphärische Teilchen: $ 6\cdot \pi \cdot r $) ergibt, und nach dem Gesetz von Stokes berechnet werden kann.

$ F=6\cdot \pi \cdot r\cdot \eta \cdot v $

Aus diesen beiden Gleichungen ergibt sich die theoretische elektrophoretische Mobilität $ \mu _{e,p}^{0} $. Theoretisch aus dem Grund, da diese beiden Gleichungen nur für einen idealisierten, trägerfreien Zustand mit unendlich verdünntem (praktisch salzfreien, was jedoch dem Prinzip der Elektrophorese widerspricht, da Salzionen als bewegliche Ladungsträger benötigt werden) Elektrolyten gelten. Weiterhin wird dabei angenommen, dass die beschleunigende Kraft der Reibungskraft entspricht und daher eine konstante Wanderungsgeschwindigkeit vorherrscht.

$ \mu _{e,p}^{0}={\frac {v}{E}}={\frac {q}{6\cdot \pi \cdot r\cdot \eta }} $

In realen Systemen kommen weitere Faktoren wie die Reibung zwischen den Hydrathüllen (elektrophoretischer Effekt), die Deformation der Ladungsverteilung als Relaxation im elektrischen Feld (dissipativer Effekt, siehe Ionenatmosphäre), der Dissoziationsgrad des Elektrolyten und Effekte durch das Trägermaterial (Molekularsieb-, Elektroosmose- und Adsorptionseffekte) zum Tragen.

Während traditionelle Theorien davon ausgehen, dass elektrophoretische Aktivität eines Teilchens eine Nettoladung des Teilchens voraussetzt, legen neue Ergebnisse aus Molekulardynamiksimulationen nahe, dass aufgrund der molekularen Struktur des Wassers an der Oberfläche auch ungeladene Teilchen elektrophoretische Aktivität zeigen können.[2]

Arten

Anwendung

Angewandt wird die Elektrophorese vor allem als Analyseverfahren in der Biologie und Medizin. Zu den wichtigsten Anwendungen gehören DNA-Analyse in Form von Fragmenten und DNA-Sequenzierung. Hierbei wird die Möglichkeit genutzt, Moleküle unterschiedlicher Länge voneinander zu trennen. Zur Bestimmung der Messwerte eines Geles wie z. B. Laufweiten, Molmassen, Quantifizierungen oder Normalisierung wird eine spezialisierte Auswertesoftware genutzt. Auch zur Trennung von Proteinen und für die hochtechnologischen Verfahren der Proteomforschung bildet die Elektrophorese die Grundlage. Die graphische Darstellung der Ergebnisse ist ein Elektropherogramm. Neben den analytischen Verfahren werden zur Gewinnung von Milligramm-Mengen gereinigter Proteine auch präparative Elektrophoreseverfahren eingesetzt (u.a. free-flow-Elektrophorese).

Weitere, technische Anwendungen:

Weblinks

  • Oliver Ratajczak: Elektrophorese. Abgerufen am 5. Januar 2010 (Gute Kurzbeschreibung zur Elektrophorese).

Einzelnachweise

  1.  Eintrag: electrophoresis. In: IUPAC Compendium of Chemical Terminology (the “Gold Book”). doi:10.1351/goldbook.E02022.
  2.  V. Knecht, H. J. Risselada, A. E. Mark, S. J. Marrink: Electrophoretic mobility does not always reflect the charge on an oil droplet. In: Journal of Colloid and Interface Science. 318, Nr. 2, 15. Januar 2008, S. 477–486, doi:10.1016/j.jcis.2007.10.035 (PDF, abgerufen am 5. Januar 2010).

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